收藏！一文搞懂ADC的Linker是个嘛玩意儿 - 上海研纷生化科技有限公司

引言：抗体药物结合物（ADC）是一种单克隆抗体，通过linker与细胞毒性化学物质（有效载荷）共价结合。ADC可以直接向癌细胞输送高细胞毒性分子来杀死它们。

研究表明，Linker在ADC药物中起着关键作用，因为它的特性极大地影响了这些药物的治疗指数、疗效和药代动力学。稳定Linker可以保持ADC在血液循环中的药物浓度，在细胞毒性药物到达目标之前不会释放，从而最大限度地减少off-target效应，并提高ADC药物的安全性。

为了使ADC具有选择性和治疗性，所采用的linker应努力实现三个关键特征：

（1）高稳定性：有效载荷在到达目标之前不会释放，从而最大限度地减少off-target效应

（2）高水溶性：有助于结合和避免形成不活跃的ADC骨料

（3）高效释放：允许高效释放高细胞毒性连杆有效载代谢物

在过去十年中，由于有效载荷、linker和偶联方法上的改进，ADC的发展取得了重大进展。特别是，Linker设计在调节ADC在体循环中的稳定性和肿瘤有效载荷释放效率方面发挥着关键作用，从而影响ADC的药代动力学（PK）、疗效和毒性特征。

1.ADC中的抗体

ADC的一个重要组成部分是单克隆抗体。为ADC设计选择抗体的基本前提是，它可以专门识别并结合肿瘤抗原受体，并在此过程中将有效载荷传递给肿瘤细胞。此外，抗体还必须对特定靶抗原具有高结合亲和力、低免疫原性、血液中的明显稳定性和低交叉反应性。

目前，ADC设计中使用的抗体大多来自人类免疫球蛋白G（IgG）亚类（IgG1、IgG2、IgG4），由两条重链和两条轻链组成。ADC靶向抗原必须在肿瘤细胞上高度表达，还应具有内化特性，以增强ADC的受体介导的内吞作用。目前，Nectin4、CD79b、CD22、CD33、HER2、CD30、FOLR1和TROP2是ADC中最具靶向的抗原。此外，70多种其他抗原正处于临床开发的各个阶段。

2.ADC中的有效载荷

有效载荷是一种旨在杀死癌细胞的强效药物。一般来说，有效载荷需要在体外肿瘤细胞上具有最大的血浆稳定性和亚纳摩尔IC50值，因为只有1-2%的注射ADC到达肿瘤。细胞毒性药物通过血液输送到全身。目前，auristatins和maytansinoids是ADC开发中最常用的药物（图2）。

图2.ADC设计中使用的细胞毒性药物

3.ADC中的Linker

Linker是ADC设计中必不可少的组件，通过共价偶联将抗体与细胞毒性有效载荷联系起来。

Linker是ADC设计的重要组成部分，它通过共价偶联将抗体连接到细胞毒性载量。对接头的关键要求是它必须确保ADC在血液中的化学稳定性（即半衰期比ADC长~10倍），并允许在内化后在靶位点快速释放有效载荷。同时，接头的适当亲水性/亲脂性，可以增强有效载荷偶联，降低免疫原性，也是Linker的一个关键方面。

图3.链接子在ADC中的作用（A）和分类（B）

ADC中使用的Linker分为两种类型：可切割Linker和不可切割的Liner（图3B）。这些Linker在确定ADC的药代动力学特性、选择性和治疗指标方面发挥着重要作用。对于不可切割的Linker，在进入溶酶体后，mAb通过蛋白水解机制进行代谢，释放的代谢物包括有效载荷、链接器和氨基酸附属物。如果有效载荷的关键药效团不受影响，对有效载荷的实质性修改也可以产生有效的ADC，就像Kadcyla的情况一样。但由于带电氨基酸附属物缺乏细胞通透性，不可切割的接头通常无法发挥旁观者效应，因此含有不可切割接头的ADC的应用范围有限，主要用于治疗血液癌或抗原表达高的肿瘤。

可切割Linker是ADC开发中使用的一大类linker。与不可切割的linker相比，可切割的linker在特定条件下将药物释放到靶细胞处。可切割linker的稳定性较差，更容易产生脱靶毒性，但它们的用途也更广，允许与更多的有效载荷一起使用。可切割接头可进一步细分为化学不稳定接头和酶可裂解接头。虽然可裂解接头在适用范围上通常优于不可裂解接头，但它们在血液循环中更不稳定。因此，可切割接头的成功取决于它们有效区分血液循环条件和靶细胞条件的能力。我们主要介绍一下ADC开发中使用的可切割接头。

4.可切割的Linker

可切割的Linker可以分为两个亚类，即化学不稳定的Linker和酶可切割的Linker。化学不稳定的Linker可以进一步归类为酸裂解Linker和可还原或二硫Linker。

4.1 化学不稳定的Linker

4.1.1 酸裂连接器：Mylotarg、Besponsa、Trodelvy

酸裂解型Linker旨在利用内体（pH 5.5-6.2）和 lysosomes（pH 4.5-5.0）的酸度，同时在pH 7.4的生理条件下保持循环稳定性。辉瑞的Mylotarg（AcBut Linker）使该策略取得了最早的临床成功。在其开发过程中，测试了一系列含肼的Linker在pH 4.5和pH 7.4的稳定性，并在小鼠体外和体内作为ADC的一部分使用，在pH 7.4稳定，在pH 4.5不稳定的Linker提供了最有效的ADC。这种Linker有效载荷也适用于Besponsa。

除了上述氢酮键外，Trodelvy使用的碳酸盐linker也是一种酸解解linker（图4B）。虽然酯键在理论上比碳酸盐在血液循环中更稳定，但实验结果表明，由前者构建的ADC在人类血清中不是很稳定。通过引入p-氨基-苄基（PABC）隔膜，ADC的血清稳定性得到了显著改善（t1/2=36小时），该隔膜对酸性溶酶体室表现出一定的选择性，t1/2在pH值5下持续10小时。

图4.Mylotarg 和 Trodelvy 的酸裂解

4.1.2 可还原或二硫Linker

尽管Mylotarg、Besponsa和Trodelvy在临床上取得了成功，但大多数ADC结扎技术中不再使用酸裂连接剂。Linker严格区分pH 5和pH 7.4环境的要求本质上是非常困难的，现在研究和开发专注于其他可以产生更高肿瘤选择性的方法。虽然在某些情况下，缓慢释放有效载荷可以产生有益的结果，但这种方法通常只适用于中度细胞毒性有效载荷，ADC现在首选的剧毒有效载荷需要更稳定的连接剂。

在Mylotarg和Besponsa中释放有效载荷不仅需要对酸敏感的氢酮键发挥作用，还需要链接器中的二硫键。二硫键在生理pH值下稳定，但容易受到硫醇的亲核攻击（图5A）。在血浆中，主要的硫醇物种是人类血清白蛋白（HSA，~422 μM）的还原形式，但由于含游离硫醇残留物的溶剂暴露有限，其对大分子的反应性受到阻碍。与血浆的还原能力有限相反，细胞质含有高水平的谷胱甘肽（GSH，1-10 mM）。血浆和细胞质的还原条件为ADC提供了选择性释放有效载荷的机会。此外，与正常组织相比，肿瘤相关的氧化应激通常会导致GSH水平升高，这为癌细胞增加了额外的选择性。

涉及二硫键水解的粘结剂有效载荷主要含有maytansinoids（DM1/3/4，图5B）和二硫氨基甲酸酯有效载荷（图5C）。与可以在还原条件下释放有效载荷的二硫键类似，许多文献报告称，Linker可以在肿瘤组织的强还原条件下释放有效载荷。

图5.还原条件下ADC药物的水解机理

4.2 酶切割型Linker

在ADC的经典作用机制中，ADC被输送到细胞的溶酶体，那里有高浓度的独特水解酶，从而为酶可切割的linker在细胞内选择性地切割提供机会。目前，使用cathepsin B是最成功的。

目前销售的药物Adcetris、Polivy、Padcev、Tivdak、Aidixi、Lumoxiti、Zynlonta和Enhertu都使用由蛋白酶B切开的多肽linker。氨基苯甲酸酯（PABC）用作自降解间隔，在蛋白水解、释放有效载荷、二氧化碳和甲酸阿扎昆后通过1、6消除自发消除（图6）。PABC保持酶活性独立于有效载荷，增加了该多肽中链接器的应用范围。所有这些linker组合在孤立的人类血浆中都具有一定的稳定性。

图6.酶切割型linker的结构和裂解机理

5.不可切割的链接器

不可切割的linker可分为两类，即硫醚或maleimidocaproyl（MC）。它们由稳定的键组成，可防止蛋白水解裂解，并确保比可切割的对应物更稳定。含有此类linker的ADC依赖于抗体的完全溶酶体酶降解来释放内在有效载荷，导致linker同时解离。

目前，Genentech/Immunogen已经成功探索了这种链接策略，例如临床批准的曲妥珠单抗（Kadcyla/T-DM1）。该ADC包含一个不可解离的SMCC linker，将DM1细胞毒素与抗HER2单克隆曲妥珠单抗的Lys残基连接起来。

与可切割的linker相比，不可切割的linker的优势在于其等位稳定性的提高。总的来说，不可切割的linker比可切割的linker提供了更大的治疗窗口，因为不可切割的ADC也可以杀死目标细胞。

6.结论

Linker通常会影响ADC的稳定性、毒性、药代动力学和药效学，因此在ADC设计中选择Linker时必须非常小心。多项研究表明，合适的Linker仍然是成功ADC的重要支柱。通常，Linker必须在循环中保持稳定，并保证在细胞内安全释放有效载荷。

合适的Linker是ADC安全性和有效性的重要保证。尽管有许多不可切割链接器的例子，但由于自由有效载荷的细胞毒性和旁观者效应的重要性，可切割Linker是大多数ADC药物的首选。未来对可切割Linker的研究预计将进一步探索结合多种作用机制的可能性，包括外源性诱导的裂解领域，该领域仍处于起步阶段。

开发新的可切割Linker还有很长的路要走，但随着我们更深入地了解不同有效载荷对肿瘤生物学的影响，以及最佳组合（payload、linker、抗体）的临床验证，最终将开发具有颠覆性功效的理想ADC，并推动个性化药物开发，以解决肿瘤学的紧急医疗需求。