背景介绍

过去三十年中，肽类治疗药物经历了快速复兴。虽然少数肽类药物是生物生产的，但大多数是通过化学合成制造的。传统的C→N肽化学合成的原则包括对α-氨基酸的氨基进行预先保护，激活其羧基，使用生长肽链的游离氨基进行氨基解，以及去保护N-末端。强制性使用Nα-保护基团意味着在引入每个氨基酸时需要两个额外的操作，导致步骤和原子经济性差。肽治疗市场的日益增长需求需要成本效益高且环境友好的肽制造策略。使用未保护氨基酸的逆向肽化学合成被提出为一种理想且吸引人的策略。然而，由于在N→C肽链延长过程中严重的消旋/表征问题，这一策略在过去60年中一直未能成功。在此，作者前期通过使用瞬时保护策略的炔胺酯偶联试剂成功解决了这一挑战。激活、瞬时保护、氨基解和原位去保护在一锅中完成，从而提供了一种实用的肽化学合成策略，正式使用未保护氨基酸作为起始材料。其稳健性通过合成肽活性药物成分得到了证明。它也适用于片段缩合和逆向固相肽合成。与绿色溶剂的兼容性进一步增强了其在大规模肽生产中的应用潜力。

底物范围

在优化的反应条件下，我们评估了20种蛋白源氨基酸作为电子吸引羧基和亲核氨基伙伴的能力。Nα-保护氨基酸通过炔胺酯偶联试剂MYTsA 2 激活，产生活性乙烯酯，直接用于氨基解步骤，无需进一步纯化。未保护的氨基酸和硅化试剂BSA在二氯甲烷（DCM）中室温搅拌1小时，然后与DMF中的活性乙烯酯溶液混合。反应混合物搅拌直至活性酯完全消耗。氨基解反应后进行酸碱处理，以优异的收率获得目标二肽酸。如下图所示，所有20种蛋白源氨基酸都可以用作羧基和氨基伙伴，以优异的收率提供目标二肽酸，没有任何可检测到的消旋/表征。即使是空间要求高的氨基酸，如Val、Ile、Pro和Aib，也能作为氨基伙伴容忍，以优异的收率提供目标二肽，尽管作为羧基伙伴使用时需要更长的反应时间。尽管羧基伙伴中的侧链官能团，如-SH、-CO2H、-NH2、酚的-OH和咪唑的NH必须保护，但当相应的氨基酸用作氨基伙伴时，-CO2H、-CONH2、-OH、-SH的保护并不是必需的。有趣的是，当未保护的精氨酸用作氨基伙伴时，不需要BSA，这归因于其碱性胍基侧链官能团（4ab）。值得注意的是，当侧链未保护的Cys（4v）和His（4ab）用作氨基伙伴时，氨基解反应时间显著缩短，这可能归因于侧链辅助效应。N-甲基α-氨基酸和非天然氨基酸（4ah-4am）如Aib、β-氨基酸和γ-氨基酸也兼容。此外，只要它们是固体，大多数二肽酸不需要色谱纯化，因为简单的酸碱处理或重结晶提供了纯二肽酸。

底物范围

受到二肽合成成功的鼓舞，作者继续进行更具挑战性的三肽合成，这涉及到高度容易发生消旋的二肽酸的激活和氨基解。然而，在优化的二肽合成反应条件下，用瞬时硅保护的H-Phe-OH处理二肽Cbz-Ala-Leu-OH的活性乙烯酯时，观察到了严重的消旋，即85:15的dr。这个结果进一步证实了肽C末端的α-手性中心比Nα-氨基甲酸酯保护的氨基酸更容易发生消旋。幸运的是，研究发现消旋是在氨基解步骤而不是激活步骤中发生的。这个结果非常重要，因为它与传统的未保护氨基酸策略不同，在传统策略中，消旋在激活和氨基解步骤中都会发生。为了证明这些策略的普遍性，接下来评估了20种蛋白源氨基酸作为酰基和氨基伴侣的可行性。如下图所示，要求高的Val和Ile作为偶联伴侣表现良好，以优异的收率提供了目标三肽。对于所有三肽底物，都没有观察到消旋。虽然采用了两步策略来详细研究三肽合成，但所有三肽都可以以两步一锅的方式合成，效果可比或更好。如二肽合成一样，氨基解速率受到酰基供体的体积影响；因此，对于具有体积较大的Val和Ile C末端的二肽酸，需要更长的反应时间（下图，7d，7e）。值得注意的是，传统的保护基团如Cbz、Boc和Fmoc是兼容的，尽管对于二肽（方案2，4c，4af，4ah）和三肽（7ae-7ai）伴随有少量的去Fmoc产物。有趣的是，对于二肽酸和三肽酸合成（4m，7m），都没有观察到天冬酰胺形成副作用反应，这可能归因于接近中性的反应条件。此外，对于二肽酸Cbz-Gly-Pro-OH的合成，也没有观察到二酮哌嗪副作用产物，而在传统的偶联策略中，其激活会导致二酮哌嗪的形成（7f）。通常，只要它们是固体，酸性水处理后简单的重结晶就能得到纯的目标三肽酸，就能保持良好的手性保留和收率。

底物范围

为了突出炔胺酯偶联试剂在抑制N→C肽链延长中遇到的消旋/表征方面的优越性，我们进行了与传统激活策略的比较研究。如下表所示，在活性物种的氨基解，如活性酯和不对称酸酐中，以及在这些活性物种的制备过程中（条目1-3），都发生了显著的消旋/表征。同时，还研究了使用现代偶联试剂进行三肽酸合成的瞬时保护策略，无需可分离的中间体。如下表所示，对于偶联试剂，如HATU、HBTU和COMU，观察到严重的消旋，这些试剂需要碱的辅助（条目6-9）。有趣的是，N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）引起的显著消旋可以通过消旋抑制剂，如HOBt、HOAt或Oxyma显著缓解（条目10-13）。然而，通过DIC和消旋抑制剂的组合，无法完全避免不希望的表征形成。在相同条件下，当MYTsA被用作偶联试剂时（下表，条目14），三肽7g可以在两步一锅的方式中以优异的收率（97%）获得，没有任何可检测到的消旋（>99:1 dr）。

底物范围

使用大量对环境不友好的氯化溶剂和DMF是绿色化学的另一个关注点。为了展示这种方法的实用性，研究了其与绿色溶剂的兼容性，并总结了代表性结果（下表）。激活和氨基解步骤在绿色溶剂中，如碳酸二甲酯（DMC）、碳酸二乙酯（DEC）、丙烯碳酸酯（PC）、N-甲酰吗啉（NFM）、γ-戊内酯（GVL）、2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）、1-丁基吡咯烷-2-酮（NBP）和1,1-二氧代四氢噻吩（Sulfolane）中顺利进行，给出与DCE和DMF相当或更好的结果。尽管在Sulfolane作为氨基解步骤的溶剂时观察到很少的消旋（下表，条目8），但DEC/Sulfolane或DEC的7:3混合物给出了最好的结果（下表，条目3和9）。还注意到加热有助于缩短反应时间（下表，条目9 vs 10）。在绿色溶剂中合成模型三肽7g的结果令人兴奋，因为不仅成功解决了肽酰酸的臭名昭著的消旋问题，还解决了困扰肽合成的有毒溶剂问题。

底物范围

为了进一步说明这一优势，研究了其在绿色溶剂DEC作为反应介质的更长肽合成中的应用。如下图所示，三肽9a-9d以优异的收率轻松制备，通过亚胺酯偶联试剂MYTsA激活，进一步在DEC中与瞬时保护的H-Ser(OtBu)-OH、H-Phe-OH、H-Met-OH和H-Glu(OtBu)-OH处理，以优异的收率提供相应的四肽（下图，10a-10d）。有趣的是，通过重复使用瞬时保护的H-Phe-OH、H-Cys(Bn)-OH进行激活和氨基解的偶联循环，可以轻松实现四肽10d的延长，分别获得目标五肽11和六肽12，收率优异。值得注意的是，在合成这些肽的整个过程中都没有观察到消旋。此外，这些肽的合成没有涉及色谱纯化，因为简单的酸碱处理和重结晶足以提供纯的目标肽产品。这些结果明确证明了这种策略在合成更长肽方面的潜力。

底物范围

瞬时保护策略的潜在应用通过使用瞬时保护氨基酸合成一系列肽APIs（下图）得到了进一步的例证。在Carfilzomib 13的合成方面，在每个肽键形成完成后，通过简单的酸性水处理和重结晶提供了带有C末端游离羧基的目标肽，为下一个偶联循环做好了准备。Carfilzomib 13的四个酰胺键（三个肽键）通过仅四个偶联步骤简洁地构建，每个肽键的平均收率为96%，而在传统的保护策略中，使用先前的Nα-保护氨基酸作为构建块，至少需要七个步骤（四个偶联和三个去保护）。由于合成路线的大幅缩短和这种策略的卓越效力，与保护策略相比，Carfilzomib 13的总收率显著提高（85% vs 68%）。值得注意的是，在13的整个合成过程中不需要柱色谱纯化，因为中间体和最终产品是直接使用或通过重结晶纯化的。对于胆囊收缩素八肽14、奥曲肽15和赖氨酸加压素16的合成，任何肽中间体都没有观察到可检测的消旋。这种策略的步骤经济性非常显著，因为瞬时保护、激活、氨基解和原位去保护可以在一锅中进行，以提供带有羧酸C末端的肽，为下一个偶联循环做好了准备。在本文中，虽然大多数肽键是通过两步法构建的，以便详细研究每一步的效率，但它们也可以通过一锅法以相当或更高的收率进行。以赖氨酸加压素16为例，在传统的肽合成策略中，构建八个肽键至少需要24步，而瞬时保护策略只需要8步。所有反应都在室温下使用常见溶剂进行，尽管加热有助于缩短反应时间。此外，大多数肽中间体不需要柱色谱纯化，从而提供了方便的操作。如方案5所示，在逆向逐步合成肽APIs中，每个肽键的平均收率在85%到97%之间。

底物范围

同时，进行了六肽Rnbiscolin-6 17的克级合成（下图），观察到比小规模合成更高的平均肽键收率（92% vs 87%）。此外，L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸的偶联没有差异，从而说明了该方法与非天然氨基酸的兼容性。

片段缩合

片段缩合是一种高效的汇聚策略，用于构建更大的肽和蛋白质。然而，传统的肽连接策略仅限于特定的连接位点，而偶联试剂介导的肽片段缩合则受到严重的消旋问题的困扰。为了说明瞬时保护策略与片段缩合的兼容性，通过3+2模式合成了两个五肽。如下图A所示，目标五肽22和25可以以优异的收率获得，并完全保留了手性完整性。这个结果说明了瞬时保护策略在合成更大肽方面的潜力。传统的C→N固相肽合成（SPPS）已经彻底改变了肽合成，并在肽制造中发挥了主导作用。相反，N→C固相肽合成（SPPS），也称为逆向固相肽合成（ISPPS），由于在N→C肽链延长过程中发生的严重消旋/表征问题，几乎被肽学界抛弃。成功的逆向固相肽合成解决方案促使评估瞬时保护策略在ISPPS中的可行性（下图B）。该研究从将Boc-Gln（树脂）-OH作为起始材料开始，该材料通过其侧链连接到树脂上。有趣的是，在通过炔胺酯偶联试剂MYTsA激活Gln的羧基后，树脂被处理未保护的氨基酸和N-三甲基硅基-2-吡咯烷酮在DCE中的混合物。在氨基解反应后，使用柠檬酸进行酸性处理，释放了C末端羧基，为后续氨基酸的偶联循环做好了准备。通过采用激活-氨基解（带瞬时保护氨基酸）-酸化的迭代重复循环，可以得到含有21个氨基酸的肽28，粗纯度为50%，与传统使用肽合成器的SPPS的粗纯度（57%，下图B(3)）相当。氯化溶剂DCE可以被绿色溶剂替换，如DEC/Sulfolane (7:3)和2-MeTHF，产生相当的反应效率。例如，使用DEC/Sulfolane的7:3混合物进行激活，以及2-MeTHF进行氨基解，与使用DCE作为溶剂获得的95%粗纯度相比，五肽26的粗纯度提高到了97%（下图B(1)）。同样，对于十肽27（下图B(2)），使用相同的溶剂组合，粗纯度达到了86%，超过了使用DCE作为溶剂时实现的84%。这个结果明确说明了这种使用瞬时保护氨基酸的逆向肽合成适用于SPPS，从而提供了一种正式的肽合成策略，使用廉价且易得的未保护氨基酸作为起始材料，而不是相对昂贵的先前Nα-保护氨基酸。此外，它与绿色溶剂的兼容性使其对工业应用更具吸引力。